Pewarnaan Tulang Alizarin Red Kadal

Pewarnaan Tulang Alizarin Red Kadal – Tulang merupakan hasil perkembangan dari kartilago atau lanjutan dari sel-sel mesenkim embrional (membrane tulang). Kartilago dan sel-sel mesenkim embrional tersebut diproduksi oleh sel-sel tulang (osteoblast). Tulang dilapisi oleh fibrous periosteum yang berfungsi untuk pertumbuhan dan perbaikan sel. Substansi mineralnya disimpan dalam lapisan tipis atau lamela. Lamela-lamela bentuk silindris membentuk sistem-sistem harversi, yang bagian tengahnya terdapat Canal Haversi.

Alizarin Red merupakan suatu metode untuk mengetahui pembentukan tulang pada embrio atau untuk mendeteksi proses kalsifikasi pada tulang embrio. Tulang yang diwarnai oleh Alizarin Red akan berwarna merah tua, yang menandakan bahwa tulang tersebut telah mengalami kalsifikasi. Warna merah tua terbentuk karena zat warna yang diberikan terikat oleh kalsium pada matriks tulang.

Metode pewarnaan alizarin red digunakan untuk mengidentifikasi bagian-bagian kerangka yang sudah terbentuk pada masa embrio serta proses kalsifikasinya. Hal ini dapat dilihat dari perubahan warna tulang menjadi merah tua. Perubahan warna ini menandakan bahwa tulang tersebut telah mengalami kalsifikasi. Warna merah tua ini dikarenakan adanya pengikatan zat warna alizarin red pada matriks tulang. Pewarnaan ini dilakukan dengan beberapa tahapan dalam pewarnaan secara berurutan pada embrio agar didapat informasi mengenai proses kalsifikasinya.

Tulang merupakan komponen utama dalam rangka tubuh vertebrata. Tulang-tulang pada kadal terdiri dari tengkorak, radius, humerus, tulang jari, ulna, tulang belikat, tulang rusuk, tulang belakang, tulang panggul, tulang paha, tulang betis, tulang telapak kaki, tulang ruas jari, dan tulang ekor. Berikut ini merupakan gambaran mengenai sistem rangka pada kadal:

Baca Juga : Membran Ekstra Embrional Kadal

Proses kalsifikasi tulang ada dua proses, yaitu: osifikasi intra membran dan osifikasi endokondral. Jaringan tulang berkembang dari osifikasi intra membran yang terjadi di dalam suatu lapisan jaringan penyambung atau dengan osifikasi endokondral yang terjadi di dalam suatu model tulang rawan. Model tersebut secara berangsur-angsur dihancurkan dan digantikan oleh tulang yang dibentuk dari sel-sel yang berasal dari jaringan penyambung periosteum di dekatnya. Jaringan tulang yang muncul pertama kali primer atau imatur, merupakan suatu jaringan sementara dan segera digantikan oleh jenis tulang definitip yang berlapis-lapis. Selama pertumbuhan tulang, daerah tulang primer, daerah resorpsi dan daerah tulang yang berlapis-lapis nampak saling berdampingan.

Pewarnaan alizarin red digunakan untuk mengidentifikasi bagian-bagian kerangka yang sudah terbentuk pada masa embrio serta proses kalsifikasinya. Hal ini dapat dilihat dari perubahan warna tulang menjadi merah tua. Perubahan warna ini menandakan bahwa tulang tersebut telah mengalami kalsifikasi. Warna merah tua ini dikarenakan adanya pengikatan zat warna alizarin red pada matriks tulang. Pewarnaan ini dilakukan dengan beberapa tahapan dalam pewarnaan secara berurutan pada embrio agar didapat informasi mengenai proses kalsifikasinya.

Pertama, embrio kadal dibersihkan dari membran ekstra embrional untuk mempermudah identifikasi tulang. Setelah bersih, embrio kadal dimasukkan ke dalam larutan alkohol 95 %, direndam selama 15 jam, kemudian dipindahkan ke dalam akuades, direndam selama 10 menit. Selanjutnya, embrio kadal dipindahkan ke larutan KOH 1 %, direndam selama 11 jam. Embrio kadal dipindahkan ke larutan pewarna alizarin red, direndam selama 10 jam., kemudian embrio kadal dipindahkan ke larutan KOH 2 %, direndam selama 30 menit (dilakukan secara bertahap dalam selang waktu 10 menit), supaya skeleton benar-benar transparan. Embrio kadal dipindahkan ke larutan penjernih A, direndam selama 1 jam, kemudian ke dalam larutan penjernih B dan C masing-masing 1 jam. Setelah itu, tulang pada embrio kadal yang terwarnai baru bisa diamati.

Alat-alat yang digunakan dalam praktikum alizarin red adalah pinset, gunting, gelas arloji atau petri dish, botol spesimen, dan pipet tetes.

Bahan-bahan yang digunakan dalam praktikum alizarin red adalah embrio Kadal (Mabouya multifasciata), larutan alkohol 95 %, larutan pewarna alizarin red, larutan penjernih (A, B, C), larutan KOH 1 %, larutan KOH 2 %, dan akuades.

Metode alizarin red adalah :

1. Alat dan bahan yang akan digunakan disiapkan.
2. Embrio kadal diletakkan di atas gelas arloji atau petri dish.
3. Embrio kadal dibersihkan dari membran ekstra embrional.
4. Setelah bersih, embrio kadal dimasukkan ke dalam botol spesimen yang telah berisi larutan alkohol 95 %. Embrio direndam dalam larutan alkohol 95 % selama 15 jam, kemudian difoto.
5. Embrio kadal dipindahkan ke botol spesimen yang berisi akuades, direndam selama 10 menit, kemudian difoto.
6. Embrio kadal dipindahkan ke botol spesimen yang berisi larutan KOH 1 %, direndam selama 10 jam, kemudian difoto.
7. Embrio kadal dipindahkan ke botol spesimen yang berisi larutan pewarna alizarin red, direndam selama 11 jam, kemudian difoto.
8. Embrio kadal dipindahkan ke botol spesimen yang berisi larutan KOH 2 %, direndam selama 30 menit (dilakukan secara bertahap dalam selang waktu 10 menit), kemudian difoto.
9. Embrio kadal dipindahkan ke botol spesimen yang berisi larutan penjernih A, direndam selama 1 jam, kemudian ke dalam larutan penjernih B dan C masing-masing 1 jam (masing-masing difoto sebelum dipindahkan ke larutan berikutnya).
10. Tulang pada embrio kadal yang terwarnai diamati.

Embrio kadal sebagai spesimen yang akan diamati proses kalsifikasi tulangnya dengan metode pewarnaan alizarin red. Pewarnaan alizarin red digunakan untuk mengidentifikasi bagian-bagian kerangka yang sudah terbentuk pada masa embrio serta proses kalsifikasinya. Hal ini dapat dilihat dari perubahan warna tulang menjadi merah tua. Pewarnaan ini dilakukan dengan beberapa tahapan dalam pewarnaan secara berurutan pada embrio agar didapat informasi mengenai proses kalsifikasinya. Alizarin red digunakan dalam uji biokimia untuk menentukan adanya pengendapan kalsifikasi oleh sel secara kuantitatif dengan kalorimeter dari garis keturunan osteogenik.

Pertama, embrio kadal dibersihkan dari membran ekstra embrional untuk mempermudah identifikasi tulang. Setelah bersih, embrio kadal dimasukkan ke dalam larutan alkohol 95 %, direndam selama 15 jam. Larutan ini berfungsi sebagai fiksatif. Embrio kadal dipindahkan ke dalam akuades, direndam selama 10 menit untuk membersihkan alkohol yang masih melekat. Selanjutnya, embrio kadal dipindahkan ke larutan KOH 1 %, direndam selama 10 jam untuk memperjelas skeleton. Embrio kadal dipindahkan ke larutan pewarna alizarin red, direndam selama 11 jam, sebagai pewarna skeleton sehingga tulang-tulang pada kadal terlihat jelas dan transparan. Kemudian embrio kadal dipindahkan ke larutan KOH 2 %, direndam selama 30 menit (dilakukan secara bertahap dalam selang waktu 10 menit), supaya skeleton benar-benar transparan. Embrio kadal dipindahkan ke larutan penjernih A, direndam selama 1 jam, kemudian ke dalam larutan penjernih B dan C masing-masing 1 jam. Larutan penjernih ini berfungsi untuk mengurangi kelebihan pewarna yang masuk ke dalam jaringan otot sehingga otot menjadi tampak jernih transparan. Setelah itu, tulang pada embrio kadal yang terwarnai baru bisa diamati.

Hasil pengamatan tulang-tulang pada embrio kadal yang terwarnai oleh metode pewarnaan alizarin red dari kelompok 2 yaitu Trunk vertebrae, humerus, ulna, radius, carpals, metacarpals, phalanges, skull, cervical vertebrae, caudal vertebrae, metatarsals, tarsals, femur, fibula, tibia, sacral vertebrae. Hasil tersebut menandakan bahwa tulang pada embrio kadal tidak terwarnai secara keseluruhan.

Tulang kadal secara lengkap terdiri dari tengkorak, radius, humerus, tulang jari, ulna, tulang belikat, tulang rusuk, tulang belakang, tulang panggul, tulang paha, tulang betis, tulang telapak kaki, tulang ruas jari, dan tulang ekor.

Hasil pengamatan pada masing-masing kelompok berbeda. Jika dibandingkan dengan kelompok lain, tulang-tulang yang terwarnai pada kelompok 2 belum terwarnai semua, kelompok yang lain juga belum terlihat semua. Hal ini bisa disebabkan karena lamanya waktu perendaman dalam setiap tahap berbeda tiap kelompok atau tidak sesuai dengan waktu yang telah ditentukan. Selain itu juga bisa dikarenakan umur embrio kadal pada tiap kelompok berbeda.

Baca Juga : Rantai Makanan Di Alam

Kesimpulan :

1. Alizarin red merupakan metode pewarnaan yang digunakan untuk mengidentifikasi bagian-bagian kerangka yang sudah terbentuk pada masa embrio serta proses kalsifikasinya. Hal ini dapat dilihat dari perubahan warna tulang menjadi merah tua.
2. Tahap-tahap pewarnaan alizarin red yaitu pembersihan embrio kadal dari membran ekstra embrional, perendaman dalam larutan alkohol 95 % selama 15 jam, perendaman dalam akuades selama 10 menit, perendaman dalam larutan KOH 1 % selama 10 jam, perendaman dalam larutan pewarna alizarin red selama 11 jam, perendaman dalam larutan KOH 2 % selama 30 menit (dilakukan secara bertahap dalam selang waktu 10 menit), perendaman dalam larutan penjernih A selama 1 jam, kemudian ke dalam larutan penjernih B dan C masing-masing 1 jam, setelah itu tulang pada embrio kadal yang terwarnai baru bisa diamati.
3. Proses pembentukan tulang disebut kalsifikasi atau osifikasi. Proses kalsifikasi tulang ada dua proses, yaitu osifikasi intra membran dan osifikasi endokondral.

Sumber

Junqueira, L. 1982. Basic Histology. Appeleton and Lange, New York.

Lesson. 1990. Atlas of Histology. W. B. Sounders, London.

Mahanthesha K.R. B.E. Kumara Swamy, Umesh Chandra, Yadav D. Bodke, K. Vasanth Kumar Pai and B.S Sherigara. 2009. Cyclic Voltammetric Investigations of Alizarin at Carbon Paste Electrode using Surfactants. Int. J. Electrochem. Sci., 4 1237 – 1247.

Yatim, W. 1983. Embryologi. Tarsito, Bandung