Setelah sebelumnya memposting tentang Pembuatan obat tradisional yang baik, kali ini akan di uraikan terkait Uji Mikrobiologis obat Tradisional Serbuk. Ada beberapa parameter yang akan di ulas, untuk lebih jelasnya silahkan di simak uraian di bawah ini.
Persiapan dan Homogenisasi Sampel Obat Tradisional Sediaan Serbuk MA PPOMN 94/MIK/06
a. Persiapan sampel
Diperlukan alat-alat untuk persiapan sampel seperti gunting, spatula, pinset dan lain-lain. Alat ini dapat disterilkan sesaat sebelum pengujian dengan pemanasan langsung. Bagian wadah yang akan dibuka dibersihkan dengan kapas beralkohol 70%, kemudian dibuka secara aseptik di dekat nyala api bunsen.
b. Homogenisasi sampel
Dengan cara aseptik ditimbang 10g cuplikan ke dalam wadah steril, ditambahkan 90 mL PDF. Jika jumlah sampel kurang dari 10 g, maka pengambilan cuplikan dan pengencer disesuaikan hingga diperoleh suspensi pengenceran 1:10 dan dikocok homogen.
Uji Angka Lempeng Total (ALT) MA PPOMN 95/MIK/06
a. Homogenisasi sampel
Dilakukan seperti MA No. 94/MIK/06, atau disesuaikan dengan jenis sampel yang diuji.
b. Pengenceran
Disiapkan 5 tabung reaksi atau lebih yang masing-masing telah diisi dengan 9 mL PDF. Dari suspensi pengenceran 10-1 dipipet 1 mL ke dalam tabung ang berisi 9 mL pengencer PDF hingga diperoleh pengenceran 10-2. Dibuat pengenceran selanjutnya hingga 10-6 atau sesuai dengan yang diperlukan. Dari setiap pengenceran dipipet 1 mL ke dalam cawan Petri dan dibuat duplo. Ke dalam setiap cawan Petri dituangkan 15-20 mL media PCA-1% TTC suhu 45 ± 10C. Cawan Petri segera digoyang dan diputar sedemikian rupa hingga suspensi tersebar merata. Untuk mengetahui strerilitas media dan pengencer dibuat uji kontrol (blanko). Pada satu cawan diisi 1 mL pengencer dan media agar, dan pada cawan yang lain hanya diisi media. Setelah media memadat, cawan diinkubasi pada suhu 35-370C selama 24-48 jam dengan posisi dibalik. Jumlah koloni yang tumbuh diamati dan dihitung.
c. Perhitungan
- Dipilih cawan Petri dari satu pengenceran yang menunjukkan jumlah koloni antara 25-250. Jumlah koloni rata-rata dari kedua cawan dihitung lalu dikalikan dengan faktor pengencerannya. Hasil dinyatakan sebagai Angka Lempeng Total dalam tiap gram atau mL sampel.
- Bila salah satu dari cawan Petri menunjukkan jumlah koloni kurang dari 25 atau lebih dari 250 koloni, dihitung jumlah rata-rata koloni, kemudian dikalikan dengan faktor pengencerannya. Hasil dinyatakan sebagai Angka Lempeng Total dalam tiap gram atau mL sampel.
- Jika terdapat cawan-cawan dari dua tingkat pengenceran yang berurutan menunjukkan jumlah koloni antara 25-250, maka dihitung jumlah koloni dari masing-masing tingkat pengenceran kemudian dikalikan dengan faktor pengencerannya. Apabila hasil perhitungan pada tingkat yang lebih tinggi diperoleh jumlah koloni rata-rata lebih besar dari 2 kali jumlah koloni rata-rata pengenceran dibawahnya, maka Angka Lempeng Total dipilih dari tingkat pengenceran yang lebih rendah (Misal pada pengenceran 10-2 jumlah koloni rata-rata 140, pada pengenceran 10-3 jumlah koloni rata-rata 32, maka dipilih jumlah koloni 140×10-2). Bila hasil perhitungan pada tingkat pengenceran lebih tinggi diperoleh jumlah koloni rata-rata kurang dari 2 kali jumlah raa-rata pada pengeceran dibawahnya maka Angka Lempeng Total dihitung dari rata-rata jumlah koloni kedua tingkat pengenceran tersebut. (Misal pada 10-2 jumlah koloni rata-rata 240, pada pengenceran 10-3 jumlah koloni rata-rata 41), maka Angka Lempeng Total adalah : (240+410)/2 x 102 = 325 x 102
- Bila tidak satupun koloni dalam cawan maka Angka Lempeng Total diinyatakan sebagai < dari satu dikalikan faktor pengenceran terendah.
- Jika seluruh cawan menunjukkan jumlah koloni lebih dari 250, dipilih cawan dari tingkat pengenceran tertinggi kemudian dibagi menjadi beberapa sektor (2,4, atau 8) dan dihitung jumlah koloni dari satu sektor. Angka Lempeng Total adalah jumlah kolni dikalikan denghan jumlah sektor, kemudian dihitung rata-rata dari
1/8 bagan cawan lebih besar dari 200 x 8 dikalikan faktor pengenceran.
- Penghitungan dan pencatatan hasil Angka Lempeng Total hanya ditulis dalam dua angka. Angka berikutnya dibulatkan ke bawah bila kurang dari 5 dan dibulatkan ke atas apabila lebih dari 5. Sebagai contoh : 523 x 103 dibulatkan menjadi 52 x 104, Untuk 83,6 x 103 dibulatkan menjadi 84 x 103
- Jika dijumpai koloni “spreader” meliputi seperempat sampai setengah bagian cawan, maka dihitung koloni yang tumbuh di luar daerah spreader. Jika 75% dari seluruh cawan mempunyai koloni “spreader” dengan keadaan seperti diatas, maka dicatat sebagai “spr”. Untuk keadaan ini harus dicari penyebabnya dan diperbaiki cara kerjanya (pengujian diulang).
- Jika dijumpai koloni spreader tipe rantai, maka tiap satu deret koloni yang terpisah dihitung sebagai satu koloni, dan bila dalam kelompok spreader terdiri dari beberapa rantai, maka tiap rantai dihitung sebagai satu koloni.
Baca Juga : Tanaman Kosmetik Tradisional Yang Sehat
Uji Angka Kapang/Khamir (AKK) MA PPOMN 96/MIK/06
a. Homogenisasi sampel
Dilakukan seperti MA no. 94/MIK/00, disesuaikan dengan jenis sampel yang diuji.
b. Pengenceran
Disiapkan 3 buah tabung yang masing-masing telah diisi 9 mL PDF. Dari hasil homogenisasi sampel, dipipet 1 mL ke dalam tabung PDF pertama, dikocok homogen hingga diperoleh pengenceran 10-1. Dibuat pengenceran selanjutnya hingga 10-4.
c. Inokulasi dan Inkubasi
Dari tiap pengenceran dipipet 0,5 mL ke permukaan lempeng media PDA, masing-masing dibuat duplo, segera lempeng digoyang dan diputar sedemikian rupa sehingga susupensi tersebar merata. Untuk mengetahui sterilitas media dan pengencer dilakukan uji blanko. Pada satu lempeng PDA diteteskan 0,5 mL pengencer disebar ratakan dan untuk diuji media digunakan satu lempeng PDA yang lain.
Seluruh lempeng PDA diinkubasi selama 5-7 hari pada suhu 20-25oC, dengan posisi tidak kebalik. Pengamatan dan penghitungan koloni kapang/khamir dilakukan mulai hari ke-2. Koloni khamir memiliki bentuk bulat kecil, putih, hampir menyerupai bakteri. Jumlah koloni yang tumbuh diamati dan dihitung.
d. Perhitungan
Dipilih cawan Petri dari satu pengenceran yang menunjukkan jumlah koloni antara 10-150. Jumlah koloni dari kedua cawan dihitung lalu dikalikan dengan faktor pengencerannya. Bila pada cawan petri dari dua tingkat pengenceran yang berurutan menunjukkan jumlah antara 10-150, maka dihitung jumlah koloni dan dikalikan faktor pengenceran, kemudian diambil angka rata-rata. Hasil dinyatakan sebagai Angka Kapang/ Khamir dalam tiap gram atau mL sampel.
Untuk beberapa kemungkinan lain yang berbeda dari pernyataan diatas, maka diikuti petunjuk sebagai berikut:
- Bila hanya salah satu diantara kedua cawan Petri dari pengenceran yang sama menunjukkan jumlah anatara 10-150 koloni, dihitung jumlah koloni dari kedua cawan dan dikalikan dengan faktor pengenceran.
- Bila pada tingkat pengenceran yang lebih tinggi didapat jumlah koloni lebih besar dari dua kali jumlah koloni pada pengenceran dibawahnya, maka dipilih tingkat pengenceran terendah (Misal: pada pengenceran 10-2 diperoleh 60 koloni dan pada pengenceran 10-3 diperoleh 30 koloni, maka dipilih jumlah koloni pada pengenceran 10-2 yaitu 60 koloni). Bila pada pengenceran yang lebih tinggi didapat jumlah koloni kurang dari dua kali jumlah koloni pengenceran bawahnya, maka diambil angka rata-rata dari ujmlah koloni dari kedua pengenceran tersebut. Hasil dinyatakan sebagai Angka Kapang dan Khamir dalam tiap gram sampel (Misal pada pengenceran 10-2 diperoleh 60 koloni dan pengenceran 10-3 diperoleh 10 koloni, maka Angka Kapang/ Khamir adalah : (6 + 10 )/2x 103 = 8 x 103
- Bila dari seluruh cawan Petri tidak ada satupun yang menunjukkan jumlah antara 10-150 koloni, maka dicatat angka sebenarnya dari tingkat pengenceran terendah dan dihitung sebagai Angka Kapang dan Khamir Perkiraan.
- Bila tidak ada pertumbuhan pada semua cawan dan bukan disebabkan karena faktor inhibitor, maka Angka Kapang dan Khamir dilaporkan sebagau kurang dari satu dikalikan faktor pengenceran terendah (<1 x faktor pengenceran terendah).
Baca : Manfaat Dan Khasiat Teh Basi Untuk Rambut
Uji Escherichia coli MA PPOMN 97/MIK/06
a. Homogenisasi sampel
Dilakukan seperti pada MA No. 94/MIK/06, disesuaikan dengan jenis sampel yang diuji.
b. Pengkayaan
Dengan cara aseptik dipipet 10 mL, suspensi hasil homogenisasi sampel kemudian diinokulasikan pada 10 mL TSB, diinkubasi pada suhu 35-37oC selama 18-24 jam.
c. Isolasi
Dari biakan pengkayaan diinokulasikan 1 sengkelit pada permukaan EMB dan/atau Endo Agar, diinkubasi pada suhu 35-37oC selama 24-48 jam, dengan posisi lempeng dibalik. Diamati koloni spesifik yang tumbuh dengan ciri-ciri bentuk bulat, diamter 2-3 mm, warna hijau dengan kilap logam dan bentuk biru kehijauan ditengahnya, dan pada Endo Agar dengan ciri-ciri koloni bulat, diameter 2-3 mm, warna merah keunguan dengan kilap logam.
d. Identifikasi dan Konfirmasi
Dipilih dua atau lebih koloni spesifik pada EMB dan/atau Endo Agar diinokulasikan pada NA atau TSA miring, kemudian diinkubasi pada suhu 35-370C selama 18-24 jam. Dari NA atau TSA miring dilanjutkan dengan uji IMVIC sebagai berikut:
- Uji Indol : Satu sengkelit biakan NA atau TSA miring diinokulasikan pada media Tryptone Broth dan diinkubasi pada suhu 37-370C selama 24-48 jam. Ke dalam biakan ditambahkan 1 mL pereaksi Indol (Kovac) dikocok dan didiamkan beberapa menit. Warna Cherry yang berbentuk cincin pada permukaan biakan menunjukkkan reaksi indol positif.
- Uji Merah Metil : Satu sengkelit biakan NA atau TSA miring diinokulasikan pada media MR-VP dan diinkubasi pada suhu 35-37oC selama 24-48 jam. Setelah diinkubasi tambahkan 5 tetes larutan Merah Metil dikocok homogen dan didiamkan beberapa menit, bila biakan menjadi merah menunjukkan hasil uji positif.
- Uji Voges Proskauer :
- Satu sengkelit biakan NA atau TSA miring diinokulasikan pada media MR-VP dan diinkubasi pada suhu 35-37oC selama 24-48 jam. Setelah diinkubasi ditambahkan 3 tetes larutan alfa naftol dan 2 tetes larutan KOH 40%, dikocok kemudian didiamkan selama beberapa menit. Jika warna biakan menjadi merah muda hingga merah menyala menunjukkan reaksi positif.
- Uji Sitrat : Satu sengkelit biakan NA atau TSA miring diinokulasikan pada Simmon’s Citrate Agar
dan diinkubasi pada suhu 36-37oC selama 24-48 jam. Jika terjadi perubahan warna
biakan menunjukkan hasil uji positif.
Uji Salmonella MA PPOMN 98/MIK/06
a. Homogenisasi Sampel
Dilakukan seperti pada MA No. 94/MIK/06, atau disesuaikan dengan jenis sampel yang diuji.
b. Pra-Pengkayaan Non-Selektif
Dengan cara aseptik dipipet 10mL suspensi hasil homogenisasi, diinokulasikan ke dalam Erlenmeyer berisi 90mL BPW dan diinkubasi pada suhu 37±1oC selama 18±2 jam.
c. Pengkayaan Selektif
Dengan cara aseptik dipipet biakan pra-pengkayaan masing-masing 1 mL ke dalam 10 mL MKTTn inkubasi pada suhu 37±1oC selama 24±3 jam dan 0,1 mL ke dalam RVS inkubasi pada suhu 41,5±1oC selama 24±3 jam. Dijaga agar maksimum suhu inkubasi tidak melebihi 42,50C.
e. Inokulasi dan Identifikasi
Dari biakan MKTTn dan RVS diinokulasikan masing-msing sebanyak 1 sengkelit pada permukaan BGA dan XLD, kemudian diinkiubasi pada suhu 37±1oC selama 24±3 jam, koloni yang tumbuh diamati. Biakan diduga Salmonella positif jika :
BGA : Tidak berwarna, merah muda hingga merah, translusen hingga keruh, lingkungan merah muda hingga merah.
XLD : Koloni translusen dengan bintik hitam ditengahnya, dikelilingi zona transparan berwarna kemerahan.
f. Konfirmasi
Dipilih dua atau lebih koloni spesifik pada BGA dan XLD, diinokulasikan pada media TSA/NA miring dilakukan uji konfirmasi sebagai berikut:
- TSIA : Koloni tersangka diinokulasikan dengan cara ditusuk dan gores pada media TSIA, diinkubasi pada suhu 37±1oC selama 24±3 jam. Perubahan warna yang terjadi diamati.
- Uji Urease : Koloni tersangka diinokulasikan pada media Urea Agar (Christensen) suhu 37±1oC. Perubahan warna biakan yang terjadi diamati.
- Uji Dekarboksilasi Lysin : Koloni tersangka diinokulsikan pada media L-Lysine decarboxylase, diinkubasi pada suhu 37±1oC selama 24±3 jam. Perubahan warna biakan dan kekeruhan yang terjadi diamati.
- Uji Voges Proskauer : Koloni tersangka diinokulsikan pada media MR-VP pada suhu 37±1oC selama 24±3 jam. Tiga tetes larutan α-naftol dan 2 tetes larutan KOH 40% ditambahkan. Perubahan warna biakan yang terjadi setelah 15 menit diamati.
- Uji Indol : Koloni tersangka diinokuasikan pada media Tryptose Broth, inkubasi pada suhu 37±10C selama 24±3 jam. Beberapa tetes larutan kovac ditambhakan. Pembentukan cincin merah diamati.
- Uji β-Galaktosidase : Disuspensikan 0,5 mL NaCl 0,85% pada biakan NA miring dalam tabung reaksi kecil steril. Sebuah cakram ONPG dimasukkan, diinkubasi pada suhu 37±1oC selama 24±3 jam.
- Uji Serologi : Satu ose biakan diambil dari TSA/NA miring, disuspensikan dengan 1tetes NaCl 0,85% dan 1 tetes air, dan dicampurkan pada kaca objek. Apabila diamati dengan latar belakang gelap dan menggunakan kaca pembesar telah terjadi aglutinasi, sebaiknya tidak dilkaukan uji serologi dengan antisera polivalen O,H dan Vi, karena telah terjadi aglutinasi sendiri (self agglutination). Apabila tidak terjadi aglutinasi sendiri, dilakukan uji serologui ssperti diatas dengan anti sera polivalen O, H dan Vi, bila terjadi aglutinasi maka salmonella positif. Untuk anti sera polivalen H, biakan Salmonella diinokulasikan pada media Na- semi padat yang diinkubasi pada 37±1oC selama 24±3 jam.
Uji Staphylococcus aureus MA PPOMN 99/MIK/06
a. Homogenisasi sampel
Dilakukan seperti pada MA No. 94/MIK/06, atau disesuaikan dengan jenis sampel yang diuji.
b. Pengkayaan
Dengan cara aseptik dipipet 10 mL suspensi dari homogenisasi sampel, ke dalam 90 mL TSB, setelah dikocok homogen diinkubasi pada suhu 35-37oC selama 24 jam.
c. Isolasi
Siapkan lempeng media VJA. Dari biakan pengkayaan diambil dengan sengkelit untuk digoreskan pada lempeng VJA. Dilakukan pula untuk kontrol positif S. aureus. Semua lempeng diinkubasi pada suhu suhu 35-37oC selama 24-48 jam dengan posisi lempeng dibalik. Diamati koloni spesisfik yang tumbuh dengan ciri-ciri sebagai berikut:
VJA : Cembung, berwarna hitam mengkilat dan media berubah menjadi kuning.
d. Konfirmasi
Dipilih koloni spesifik dari biakan VJA untuk diinokulasikan pada media BHIB, kemudian diinkubasi pada suhu suhu 35-37oC selama 24 jam dilanjutkan dengan uji koagulase. Dipipet 0,2-0,3 mL biakan BHIB ke dalam tabung reaksi kecil steril ditambhakan 0,5 mL plasma kelinci, diinkubasi pada suhu suhu 35-37oC selama 4-6 jam. Dimati adanya koagulasi plasma. Jika terjadi koagulasi dinyatakan s. aureus positif dalam sampel.
e. Uji Mikroskopik
Dari NA miring dibuat perwarnaan Gram.
S. aureus adalah gram positif bentuk kokus dan berwarna ungu atau biru.
Uji Pseudomonas aeruginosa MA PPOMN 101/MIK/06
a. Homogenisai Sampel
Dilakukan seperti pada MA No. 94/MIK/06, atau disesuaikan dengan jenis sampel yang diuji.
b. Pengkayaan
Dengan cara aseptik dipiet 10 mL suspensi dari hasil homogenisasi sampel ke dalam 90 mL TSB, setelah dikocok homogen diinkubasi pada suhu 35-37oC selama 24 jam.
Dilakukan uji juga terhadap biakan kontrol positif Pseudomonas aeruginosa.
c. Isolasi
Dari biakan pengkayaan digoreskan dengan sengkelit pada permukaan media lempeng CETA dan diinkubasi pada suhu 35-37oC selama 24-72 jam. Diamati adanya pertumbuhan koloni spesifik berwarna kehijauan. Selanjutnya dibuat suspensi pekat dalam 0,5 mL TSB untuk diinokulasikan pada media lempeng PAP, PAF, dan NA miring. Semua media diinkubasi pada suhu 35-370C selama 24 jam untuk NA miring dan 72 jam untuk PAP dan PAF.
d. Konfirmasi
Dari biakan hasil isolasi dilakukan uji-uji sebagai beirkut:
- Uji Pigmen : Koloni yang tumbuh pada PAF berwarna kuning kehijauan, di bawah sinal ultra violet akan berfluoresensi kekuningan. Sebagaian biakan berpigmen, diambil lebih kurang 1 g dimasukkan ke dalam tabung reaksi, ditambahakan 1-2 mL air suling, dikocok kuat, kemudian ditambahkan 1-2 mL kloroform dan dikocok lagi. Pigmen fluoresin larut dalam air dan tidak larut dalam kloroform. Koloni yang tumbuh pda lempeng PAP yang berwarna hijau kebiruan di bawah sinar UV akan berfluroesensi kebiruan. Sebagian biakan berpigmen, diambil lebih kurang 1 g dimasukkan ke dalam tabung reaksi, ditambahkan 1-2 mL air suling, dikocok kuat, kemudian ditambakan 1-2 mL kloroform dan dikocok lagi. Pigmen piosianin larut dalam air dan kloroform.
- Uji Oksidase : Dari NA miring diambil 1 sengkelit biakan menggunakan sengkelit platina atau batang kaca, kemudian ditotolkan pda kertas sitokrom atau kertas saring yang telah diimpregnasi (dijenuhkan) dengan N,N-N’N tetra metil p- fenilendiamin dihidroklorida 0,5%. Pembentukan warna merah muda yang berubah menjadia ungu pada bekas totolan dalam waktu 20-60 detik menunjukkan uji oksidase positif.
- Uji Pertumbuhan Suhu 41-42oC : Dari baikan NA miring diambil 1 sengkelit untuk diinokulasikan pada 10 mL TSB dan diinkubasi pada suhu 41-42oC selam 24-48 jam.
- Uji Mikroskopik : Dari NA miring dibuat pewarnaan gram dan diamati dengan mikroskop.
Baca : Kangker Leher Rahim (Serviks)
Refrensi
BBPOM, 2006, Metode Analisis PPOMN. Pusat Pengujian Obat dan Makanan, Jakarta.
Forsythe, S.J. dan Hayes P.R., 1998. Food Hygine, Microbiology and HACCP,Aspen Publisher, Inc. All right reseved, Maryland: 277-303.
Http://www.pom.go.id/public/balai/pdf/profile-yogya.pdf. Diakses tanggal 5 Februari 2012
Jenie, B.S.L., 1997. Sanitasi dan Hygine pada Pengolahan Pangan, Makalah Pelatihan Pengendalian Mutu dan Kemanan bagi Staf Pengajar, Pusat Studi Pangan dan Gizi (CFNS)-IPB, Bogor: 1-24.
Lestari dkk., 1986. Isolasi dan Identifikasi Cendawan-cendawan Toksisi pada Jamu, Dalam Kumpulan hasil-hasil Penelitian Bidang Obat-obatan Tradisional, Airlangga University Press, Surabaya: 1-5.
Siregar, L. 1990. Cemaran Mikroba Jamu. Ditjen POM Depkes RI, Jakarta. SK Menkes RI. 1994. Daftar Metode Mikrobiologi Obat Tradisional Nomor 661.Depkes:
Jakarta.