Teknik Isolasi Mikroba – Di alam populasi mikroba tidak terpisah sendiri menurut jenisnya, tetapi terdiri dari campuran berbagai macam mikroba. Di dalam laboratorium populasi bakteri ini dapat diisolasi yaitu dipisahkan dari campurannya sehingga diperoleh kultur murni.
Dalam mempelajari mikroba maka status kemurnian sangat menentukan keberhasilan. Hal ini sangat terkait pada sifat mikroba yang umumnya bersel tunggal. Pada mikroba perkembangan jumlah sel lebih menentukan dibandingkan peningkatan volume sel sehingga kemurnian sel dari awal akan sangat menentukan pada tahap kerja berikutnya. Setelah sel benar-benar murni, maka tahapan kerja berikutnya dapat dilakukan seperti pengamatan mikromorfologi, makromorfologi, biokimiawi dan molekuler.
Isolasi didahului dengan menumbuhkan mikroba dari sampel. Sampel dapat berupa apa saja atau berasal dari mana saja sesuai dengan tujuan atau kebutuhan. Dari suatu lingkungan pengambilan sampel dapat dilakukan dengan metoda yang umum dilakukan pada pengambilan sampel untuk kepentingan ilmiah lainnya, misalnya dengan cara random sampling. Pada cara ini, sampel dari tanah misalnya, diambil dari tempat-tempat yang ditentukan secara acak. Dengan cara purposive random sampling, misalnya sampel dari permukaan perakaran, maka tanaman dapat kita pilih sesuai kebutuhan tetapi penentuan pada bagian akar yang mana dapat dilakukan dengan memilih potongan-potongan akar secara acak. Adapun untuk beberapa kasus dapat sepenuhnya purposif sampling yaitu dengan tujuan atau target yang jelas, misalnya pada kasus keracunan makanan, maka sampel langsung diambil dari muntahan, tinja, alat makan dan sisa makanan. Selanjutnya sampel padatan dapat diproses secara maserasi, bilas (rinse) atau usap atau ulas (swab).
Sampel harus dipreparasi dulu sebelum diisolasi mikrobanya.Sampel padat bisa berupa tanah, simplisia tanaman obat, obat kadaluwarsa, makanan dan sebagainya. Adapun sampel air dapat berupa air sungai, air minum kemasan, sirup dan sebagainya.
Baca : Pengenalan Alat Dan Teknik Laboratorium Mikrobiologi
Bahan dan Alat
Pada praktikum ini bahan yang digunakan antara lain:
- Air
- Sampel (dapat bahan makanan)
- Media pertumbuhan mikroba (NA)
Adapun alat-alat yang digunakan antara lain:
- Botol sampling steril
- Cotton bud steril
- Mortar dan patle
- Tabung reaksi
- Cawan patri
- Jarum ose
- Batang drügalsky
- Mikropipet
- Pembakar bunsen
Cara Kerja
1. Preparasi dan pengambilan sampel air
Sampel dari air mengalir diambil dengan botol steril dengan mulut botol miring melawan arus air. Bila pengambilan sampel dilakukan pada air yang tenang, botol dapat dicelupkan dengan tali, jika ingin mengambil sampel dari air keran maka sebelumnya mulut keran dibakar atau disterilkan dengan disinfektan dan air dialirkan dulu beberapa menit selanjutnya air sampel ditampung dalam botol steril.
Baca Juga : Pembuatan Media Pertumbuhan Mikrobiologi
2. Preparasi sampel padat
- Swab (ulas), dilakukan menggunakan cotton bud steril yang dilembapkan dengan akuades, pepton water atau air garam fisiologis steril selanjutnya cotton bud diusapkan pada permukaan sampel dengan luasan tertentu, misalnya 2x2cm2. Selanjutnya cotton bud diulaskan pada permukaan media atau dimasukkan ke dalam akuades steril untuk proses pengenceran.
- Rinse (bilas) dilakukan dengan melakukan penimbangan sampel padat sebanyak 1 g, selanjutnya bahan dimasukkan ke dalam aquades, air pepton atau air garam fisiologis steril dengan perbandingan 1:9 (w/v). Selanjutnya dilakukan satu seri pengenceran dan dilanjutkan plating pada media.
- Maseration (maserasi, pengancuran), sampel padat dapat ditumbuk dengan mortar dan pestle kemudian ditimbang 1 g dan dilarutkan ke dalam aquades, air pepton atau larutan garam fisiologis sebanyak 9ml. Selanjutnya dilakukan seri pengenceran dan plating pada media padat.
3. Preparasi sampel padat atau cair dengan teknik pengenceran bertingkat
Sampel cair sebanyak 1 ml atau sampel padat sebanyak 1 g (berat basah, dapat dikonversi ke berat kering setelah dari sumber sampel yang sama dianalisa kadar airnya). Tujuan dari pengenceran bertingkat ini adalah untuk memperkecil atau mengurangi jumlah mikroba yang tersuspensi dalam cairan sehingga memudahkan penghitungan mikroba yang tumbuh dan proses isolasi.
Cara Kerja :
- Sampel yang mengandung bakteri dimasukan ke dalam tabung pengenceran pertama (1/10 atau 10-1) secara aseptis. Perbandingan berat sampel dengan volume tabung pertama adalah 1 : 9 selanjutnya dikocok agar merata.
- Diambil 1 ml dari tabung pertama (10-1) dengan pipet ukur kemudian dipindahkan ke tabung kedua (10-2) secara aseptis kemudian dikocok Pemindahan dilanjutkan hingga tabung pengenceran terakhir dengan cara yang sama, hal yang perlu diingat bahwa pipet ukur yang digunakan harus selalu diganti.
- Dari pengenceran yang disediakan misal 10-5 diambil 0,1 ml dan dituang dalam media padat, selanjutnya diratakan dengan batang drügalsky. Maka dengan asumsi satu koloni berasal dari 1 sel, maka koloni yang tumbuh menunjukkan jumlah sel mikroba pada sampel setelah dikalikan dengan faktor pengencernya yaitu 106 (ingat pengambilan 0,1 ml dari 10-5 menjadikan konsentrasi tiap 1 ml adalah 10-6 dari konsentrasi sel mikroba awal). Jika menggunakan cara pour-plating, maka volume yang dituang adalah 1ml, sehingga jumlah sel awal digambarkan sebagai jumlah koloni dikalikan faktor pengencer (105). Teknik pour-plate atau spread-plate merupakan teknik penanaman mikroba yang akan diterangkan lanjut di bawah ini:
4. Teknik penanaman dengan plating (taburan)
Teknik penanaman ini merupakan lajutan dari pengenceran bertingkat. Pengambilan suspensi dapat diambil dari pengenceran mana saja tapi biasanya untuk tujuan isolasi diambil beberapa tabung pengenceran terakhir.
a. Spread Plate (agar tabur ulas)
adalah teknik menanam dengan menyebarkan suspensi bakteri di permukaan media agar sehingga diharapkan sel tunggal tumbuh menjadi satu koloni tunggal yang terpisah satu dari lainnya. Adapun prosedur kerja yang dapat dilakukan adalah sebagai berikut :
- Ambil suspensi cairan senamyak 0,1 ml dengan pipet ukur kemudian teteskan diatas permukaan agar yang telah memadat dan diratakan dengan batang drügalsky setelah disterilkan dengan cara dicelup alkohol dan dibakar.
b. Pour Plate (agar tuang)
Adalah tehnik menanam suspensi bakteri dengan cara menuangkan 1 ml suspensi bakteri ke dalam petridish steril, selanjutnya dituangi 15 ml media agar yang siap memadat (suhu ~45oC). Selanjutnya campuran tersebut digoyang agar merata dan ditunggu memadat sebelum diinkubasi.
5. Teknik penanaman dengan goresan (streak)
Teknik ini ditujukan untuk memisahkan satu sel mikroba dari campurannya sehingga diperoleh kultur murni. Sampel dapat berasal dari cairan, padatan atau hasil prosesnya (misalnya dari hasil pengenceran) atau dari hasil proses sebelumnya yang masih belum mampu menunjukkan sebagai kultur murni.
Pada dasarnya pemisahan atau isolasi dengan cara ini dapat dilakukan dengan berbagai cara goresan yang intinya adalah pada akhir goresan akan tumbuh koloni yang terpisah-pisah yang berasal dari pertumbuhan 1 sel.
Baca Juga : Aktivitas Enzimatis Mikroorganisme
Kunci keperhasilan teknik ini adalah:
- mengambil sampel secukupnya (jika perlu jarum ose hanya disentuhkan pada sampel),
- goresan cepat dan rapat tanpa tekanan sehingga sebagian besar mikroba akan tertinggal pada goresan-goresan awal dan permukaan media tidak luka.
- Goresan akhir yang ringan, tanpa tekanan dan sepanjang mungkin, supaya sisa sampel atau mikroba pada loop ose terdistribusi dengan baik dan akan tumbuh sebagai koloni-koloni tunggal yang terpisah.
Bentuk goresan dapat beragam sebagai berikut:
1. Sinambung tunggal
2. Goresan T, pada cara ini setiap mau pindah bidang ose dapat dibakar lebih dulu, selanjutnya goresan yang dibuat disentuhkan pada goresan sebelumnya.
3. Goresan Kuadran
