AKTIVITAS ENZIMATIS MIKROORGANISME – Salah satu teknik dasar kerja mikrobiologi adalah eksaminasi, atau pengujian. Kegiatan pengujian terhadap mikroba antara lain dapat dilihat pada kemampuan biokimiawinya yaitu kemampuan menggunakan beragam sumber karbon.
Mikroba memerlukan C sebagai salah satu makronutrien. Untuk mendapatkannya maka mikroba harus mengambil dari lingkungan, akan tetapi bahwa membawa masuk sumber karbon itu memerlukan usaha lain diantaranya yaitu memecah sumber C komplek menjadi molekul sederhana sehingga mudah ditransport ke dalam sel.
Tidak semua mikroba dapat menggunakan sumber C yang sama. Kemampuan enzimatik tersebut menjadi salah satu parameter eksaminasi suatu mikroba. Sesungguhnya bukan hanya enzim pemecah senyawa C tetapi karakter lain meliputi enzim-enzim yang berperan pada pemecahan protein, lemak dan enzim-enzim respirasi.
Baca juga : Pembuatan Media Pertumbuhan Mikrobiologi
Bahan dan Alat
Bahan yang digunakan meliputi bakteri Escherichia coli dan Bacillus subtilis, media Starch Agar, Media Skimmed Milk Agar, Media TSIA, Media Nutrient Agar, hidrogen peroksida, N,N,N,N-tetramethilphenylenedeamine, iodine lugol, Rhodamine Agar atau Tributyrine Agar.
Cara Kerja
Uji Amilolitik
Amilum adalah senyawa yang memiliki berat molekul tinggi, terdiri atas polimer glukosa yang bercabang-cabang yang diikat dengan ikatan glikosidik. Degradasi amilum membutuhkan enzim amilase yang akan memecah/menghidrolisis menjadi polisakarida yang lebih pendek (dextrin), dan selanjutnya menjadi maltosa. Hidrolisis akhir maltosa menghasilkan glukosa terlarut yang dapat ditransport masuk ke dalam sel.
Prosedur di bawah ini menunjukkan aktivitas amilase. NA yang tersuspensi pati digunakan sebagai media. Indikator yang dipakai adalah iodine. Amilum akan bereaksi dengan iodine membentuk komplex warna biru hitam yang terlihat pada media. Warna biru hitam terjadi jika iodine masuk ke dalam bagian kosong pada amilum yang berbentuk spiral.
Cara Kerja :
- Inokulasi Nutrient Agar yang mengandung pati (2 g/l) dengan E.coli dan Bacillus sp. secara streak kontinyu.
- Inkubasi selama 48 jam pada suhu 37oC
- Setelah selesai inkubasi, tetesi cawan dengan lugol’s iodine secukupnya sehingga seluruh permukaan terkena.
- Hidrolisis zat pati terlihat sebagai zona jernih di sekeliling koloni, sedangkan hasil negatif di sekitar koloni tetap berwarna biru hitam.
Uji Lipolitik
Lemak merupakan senyawa berberat molekul tinggi yang menyimpan energi yang tinggi. Degradasi lipid seperti trigliserida dilakukan oleh lipase dan esterase yang memecah ikatan ester pada molekul ini dengan menambahkan air sehingga terbentuk gliserol dan asam lemak.
Terdapat berbagai macam prosedur untuk mengetahui aktivitas lipase diantaranya adalah dengan menggunakan media Tributyrin Agar, Rodhamine Agar dan Spirit Blue Agar. Pada prinsipnya metode-metode di atas menggunakan indikator yang mampu mendeteksi keberadaan asam lemak yang terbentuk akibat hidrolisis lemak. Umumnya jika digunakan indikator pH, maka adanya asam lemak menyebabkan pH asam di sekeliling koloni, atau indikator Rodhamine menyebabkan floresensi di sekeliling koloni.
Rodhamine Agar memiliki komposisi Nutrient Agar yang ditambah olive oil, rodhamine dan gum arab. Sumber lemak didapatkan dari olive oil. Olive oil akan sukar larut jika hanya dicampur dengan NA, oleh karena itu digunakan gum arab sebagai emulsifier sehingga lemak dapat larut dalam air. Warna media coklat keruh dan setelah ditambahkan rodhamine 0,01% menjadi pink.
Cara Kerja :
- Inokulasikan Bacillus sp. dan E. coli pada Tributyrin Agar.
- Inkubasi pada suhu 37oC selama 48 jam.
- Letakkan cawan dalam UV cabinet, kemudian nyalakan lampu UV pada panjang gelombang 366 nm. Lipase positif ditunjukkan adanya floresensi berwarna orange di sekitar koloni. Hasil negatif, jika koloni tidak berpendar
Uji proteolitik
Uji proteolitik yang dilakukan dalam praktikum ini adalah untuk mengetahui adanya hidrolisis kasein. Kasein merupakan protein penyusun sebagian besar susu yang terdiri dari polimer asam amino yang diikan oleh ikatan peptida. Kasein dapat didegradasi oleh enzim setahap demi setahap menjadi pepton, polipeptida, dipeptida dan molekul penyusunnya, asam amino. Proses ini dinamakan peptonisasi atau proteolisis yang dikatalisis oleh enzim ekstraseluler protease. Prosedur hidrolisis kasein menggunakan media Skim Milk Agar yang mengandung kasein. Protein susu menampakkan kekeruhan (koloid). Hidrolisis protein oleh enzim menyebabkan kekeruhan tersebut hilang yang ditunjukkan oleh zona jernih.
Cara Kerja :
- Inokulasikan Bacillus sp. dan E. coli pada Skim Milk Agar (SMA).
- Inkubasi pada suhu 37oC selama 48 jam.
- Aktivitas proteolitik ditunjukkan oleh terbentuknya zone jernih di sekeliling koloni.
Uji Oksidase
Enzim oksidase memegang peranan penting dalam transport elektron selama respirasi aerobik. Sitokrom oksidase mengkatalisis oksidasi dan reduksi sitokrom oleh molekul oksigen. Kemampuan bakteri memproduksi sitokrom oksidase dapat diketahui dari reaksi yang ditimbulkan setelah pemberian reagen oksidase tetramethyl-D-phenylenediamine dihydrocloride pada koloni bakteri. Reaksi positif ditandai pembentukan warna biru kehitaman. Tidak adanya perubahan warna mengindikasikan bahwa uji yang dilakukan negatif.
Cara Kerja :
- Koloni bakteri diambil satu ose, oleskan pada kertas saring lembab.
- Tetesi dengan reagen, lalu lihat perubahan yang terjadi.
- Jika warna berubah menjadi biru marun maka hasil uji positif, sedangkan bila tidak terjadi perubahan maka hasil uji negatif. Hasil uji positif tertunda jika warna biru muncul antara 10-60 detik setelah ditetesi.
Uji Katalase
Selama respirasi aerobik (proses fosforilasi oksidatif), mikroorganisme menghasilkan hidrogen peroksida, bahkan ada yang menghasilkan superoksida yang sangat beracun. Senyawa ini dalam jumlah besar akan menyebabkan kematian pada mikroorganisme. Senyawa ini dihasilkan oleh mikroorganisme aerobik, fakultatif aerob maupun mikroaerofilik yang menggunakan jalur respirasi aerobik.
Superoksida dismutase adalah enzim yang bertanggung jawab untuk penguraian khususnya superoksida pada organisme aerob yang bersifat katalase negatif. Produksi katalase bisa diidentifikasi dengan menambahkan H2O2 berkonsentrasi 3% pada suspensi bakteri. Reaksi positif ditandai pembentukan gelembung gas.
Cara Kerja :
- Koloni bakteri umur 24 jam diambil satu ose secara aseptis dan diinokulasikan pada object glass.
- Dengan menggunakan pipet tetes, H2O2 diteteskan pada object glass secukupnya.
- Amati adanya gelembung untuk hasil positif dan tidak ada gelembung untuk hasil negatif.
Baca Juga : Pengenalan Alat Dan Teknik Laboratorium Mikrobiologi