Isolasi Dan Uji Bakteri Termofilik Penghasil Protease – Mikroorganisme termofilik dapat dengan mudah ditemukan pada daerah dengan aktivitas geothermal, pegunungan berapi, sumber air panas dan pada daerah cadangan minyak bumi dan batu bara (Van Den Burg, 2003). Enzim-enzim termostabil dapat dihasilkan dari mikroorganisme yang hidup pada suhu tinggi. Enzim-enzim termostabil saat ini sedang mendapat perhatian besar, karena enzim-enzim ini sangat cocok untuk proses-proses industry yang memerlukan suhu tinggi (Rakshit, 2003).
Protease merupakan enzim proteolitik yang mengkatalisis pemutusan ikatan peptida pada protein. Protease dibutuhkan secara fisiologi untuk kehidupan organisme pada tumbuhan, hewan maupun mikroorganisme (Rao et al., 1998).
Pengambilan sample
Sample diperoleh dari sumber air panas Pancuran Tujuh, Baturaden Kabupaten Banyumas, Jawa Tengah. Sample diambil pada bagian dasar dan permukaan aliran air panas dengan cara memasukan ke dalam botol winkler steril. Suhu dan ph pada sumber air panas diukur sebagai data pendukung. Sample yang telah diambil segera dibawa ke laboratorium,
Isolasi dan seleksi bakteri proteolitik termofilik
Sebanyak 0,1ml air dan lumpur dimasukan ke dalam media selektif SMA (skim milk agar) dengan ph 6,5 ( widhiastuti & Dewi, 2001) lalu diinkubasi pada suhu 65¼C selama 48 jam. Koloni isolate yang memiliki zona proteolitik di amati warna, tepi, elevasi dan bentuk koloni. Koloni yang memiliki nilai aktivasi hidrolisis kemudian dibuat biakan murni pada media SMA.
Uji kemampuan aktivitas proteolitik isolate
Masing-masing bakteri yang menunjukan aktivitas proteolitik ditumbuhkan pada media selektif agar SMA (ph 6,5), diinkubasi pada 65ºC selama 48jam. Zona hidrolisis protein diukur dengan membandingkan diameter zona jernih dengan diameter koloni. Hasil bagi tersebut merupakan kekuatan enzim secara nisbi ( Widhyastuti & Dewi, 2001). Isolate yang memiliki aktivitas proteolitik tinggi kemudian dikarakterisasi dan diperbanyak untuk proses selanjutnya.
Karakterisasi sifat morvologi dan isolate terpilih
Beberapa isolate terpilih dikarakterisasi sifat morfologi dan biokimianya, yaitu mencakup bentuk sel, motilitas dan Gramnya. Motilitas diamati dengan menggunakan media semi padat (sulfide indole motility agar) SIMA. Pewarnaan gram menggunakan pewarna Kristal ungu violet dan safranin untuk menentukan sifat gram. Sifat biokimia yang diamati mencakup uji sitrat menggunakan simons citrate agar (SCA), uji glatin dengan media Nutrien glatin, dan uji katalase dengan menggunakan H¬2O2 (Capucino & Ferman, 1983).
Pengujian aktivitas protease
Pengukuran aktivitas enzim dilakukan berdasarkan metoda Ward (1984) yang dimodifikasi. substrat yang digunakan adalah kasein 1 % dilarutkan kedalam buffer posfat (50 mM, pH 6,5) dan enzim yang telah dipreinkubasikan selama 5 menit. Campuran tersebut diinkubasikan selama 10 menit pada suhu yang berbeda yaitu : 50ºC, 55ºC, 60ºC, 65ºC,70ºC,75ºC dan 80ºC. reaksi enzimatis dihentikan dengan menurunkan suhu sampai 5ºC pada lemari pendingin. Kemudian disentrifugasi dengan kecepatan 10.000 rpm selama 20 menit. Pada 1 ml supernatan di tambahkan Na2CO3 0,5 M dan pereaksi folin ciocalteus (1:2), campuran diinkubasi 20 menit pada suhu 50 0C. Absorbansi dibaca pada panjang gelombang 578 nm. Aktivitas enzim protease ditentukan dengan menginterpolasikan nilai absorbansi kedalam persamaan regresi dari kurva standar tirosin yang didapatkan. Blanko dibuat dengan cara yang sama, namun enzim diinaktifkan dahulu dengan direaksikan dengan 1 ml TCA. Satu unit aktivitas enzim didefinisikanb sebagai jumlah enzim yang membebaskan 1 μmol tirosin permenit pada suhu dan pH optimum (Sugiyono, 2003)
Cappuccino JG & Sherman N. 1983. Microbiology a Laboratory Manual. 4¬¬th ed. Menlo park Addision-Wesley Publ. Company, inc.
Rakshit SK & Haki GD. 2003. Development in Industrially important thermostable enzymes; a review. Bioproces Technology Program, Asian Institute of Techology (AIT). P.O.Box 4, Klong Luang, Phathumthani,12120, Thailand.
Rao, M.B., (1998), Molecular and Biotechnological Aspects of Microbial Proteases Microbiology and Molecular Biology Rev, Sci Am, 62 : 597-635
Van den burg B. 2003. Extremophiles as a sourch for novel enzymes. Curr Opinion in Microbiol.6: 213 318.
Widhyastuti N & Dewi RM.2001. Isolasi bakteri proteolitik dan optimasi produksi protease. Laporan Teknik Proyek Inventarisasi dan Karakterisasi Sumber daya Hayati. Pusat Penelitian Biologi. LIPI.