Cara Isolasi dan Identifikasi Bacillus sp. – Populasi mikroba di alam merupakan populasi campuran dari berbagi mikroorganisme atau disebut juga biakan campuran. Teknik biakan murni digunakan untuk memisahkan berbagai macam bakteri tersebut. Peranan bakteri baik yang menguntungkan ataupun yang merugikan dalam kehidupan kita dapat diketahui melalui proses isolasi dan identifikasi. Prinsip isolasi adalah memisahkan suatu mikroba dari mikroba lainya sehingga diperoleh kultur murni. Suatu organism harus diklasifikasikan sebelum diidentifikasi.
Identifikasi dilakukan untuk mengetahui spesies bakteri wild tipe yang diperoleh untuk selanjutnya digunakan untuk berbagai keperluan; selain itu proses tersebut juga berfungsi untuk mengecek ulang (uji konfirmasi) isolasi yang telah diketahui spesies dan karakternya, sehingga dapat memperkecil kesalahan pada hasil uji yang dilakukan. Pendekatan yang dapat dilakukan dalam uji identifikasi yaitu dengan pendekatan konvensional (mikrobiologis) dan pendekatan molekuler.
Bacillus sp. Dapat diisolasi dari tanah. Bacillus.sp merupakan bakteri gram positif dengan sel batang berukuran 0,3-2,2 x 1,27-7 mikro meter, sebagian bersifat motil, jika di panaskan akan membentuk endospora, bersifat aerob sampai anaerob fakultatif, metabolism dengan fermentasi dan respirasi. Untuk memastikan bahwa koloni koloni tersebut adalah bacillus, maka dilakukan serangkaian pengujian yang bersifat spesifik yaitu pewarnaan gram, pewarnaan negative dan motilitasnya.
Bacillus diformulasikan dalam family Bacillaceae pertama kali oleh Fisher pada tahun 1895 (Gordon,1981). Bacillus dibedakan dari anggota familia Bacillaceae lainya berdasarkan sifat-sifatnya yaitu ;keseluruhanya merupakan pembentuk spora,hidup pada kondisi aerob sampai anaerob fakultatif, selnya berbentuk batang, dan memproduksi katalase. Spora Bacillus memiliki daya tahan terhadap panas, iridiasi, dan desikasi 1000 kali lebih kuat dibandingkan dengan sel vegetative (Levin et.al.,1992). Bacillus adalah bakteri yang tahan terhadap pemanasan,termasuk gram positif, membentuk spora, bersifat aerob sampai anaerob fakultatif, dan bacillus kebanyakan adalah saprofit. Masing-masing bacillus hanya menghasilkan satu spora yang resisten terhadap perlawanan suhu, radiasi,desikasi dan desinfektan.
Materi Dan Metode
A. Materi
Materi yang digunakan dalam praktikum ini meliputi alat dan bahan. Peralatan yang digunakan dalam praktikum adalah jarum ose, objek glass, mikroskop, micrometer, kertas merang, tabung reaksi, pipet tetes, beaker glass, cawan petri, oven, pembakar sepirtus, incubator, wrapper.
Bahan yang digunakan dalam praktikum adalah akuades, alcohol 70%, medium Nutrient Agar (NA), Nitrat Broth (NB), malachite green, starch agar (SA), SIMA semisolid, SMA (skin milk agar), simone citrat, MR-VP Broth, KOH-alfanaftol, reagen A dan B, NaCl (6,5 dan 10%), Kristal violet, lugol’s iodine, safranin, etanol 96%, reagen H2O2, medium NB + NaCl ,reagen laktosa dan rafinosa, reagen oksidase.
B. Metode
Pengambilan sampel
1. Pengambilan dilakukan secara aseptis
2. Alumunium foil disiapkan yang sebelumnya disterilkan terlebih dahulu dengan alcohol 70%
3. Sampel diambil dengan cepat dan dengan hati-hati dimasukan kedalam alumunium foil steril kemudian ditutup rapat
Tahap isolasi bacillus
1. Preparasi
Tahap Pemurnian dengan Metode Streak Kuadran
1. Dipilih satu koloni yang nampak terdiri satu tipe sel
2. Jarum ose dibakar, setelah dingin disentuhkan ke permukaan koloni bakteri yang akan distreak pada plating NA.
3. Streak ini dianggap sebagai streak primer pada permukaan NA
4. Jarum ose dibakar, angkat lalu didinginkan dan distreakan melewati streak primer kesatu atau kedua dan kemudian dilanjutkan streak sekunder tanpa kembali ke streak primer
5. Jarum ose dibakar, angkat lalu didinginkan dan distreakan melewati streakan sekunder dan kemudian dilanjutkan streak tersier tanpa kembali ke streak sekunder dan primer
6. Plating diinkubasi pada suhu 300C selama 2x24jam.
Pengamatan Morfologi Koloni
1. Pengamatan morfologi koloni dilakukan pada koloni tunggal yang terbentuk setelah pemurnian dengan streak kuadran
2. Bentuk koloni, bentuk tepi, elevasi dan lainnya diamati.
Pengamatan morfologi koloni
1. Dibuat biakan pada media Nutrien Agar (NA) cawan
2. Inkubasi 2×24 jam pada suhu 300C
3. Perbedaan bentuk koloni, bentuk tepi, elevansi dan lainya diamati.
Pengukuran Panjang dan Lebar Sel
1. Disiapkan mikroskop yang telah dipasang micrometer okuler yang telah terkalibrasi
2. Dibuat preparat ulas bakteri uji dan bakteri control positif maupun negatif.
3. Diukur panjang dan lebar sel kemudian dihitung panjang dan lebar sel sebenarnya
Uji Pewarnaan Gram
1. Dibuat ulasan bakteri pada object glass,difiksasi
2. Ditetesi dengan gram A (Kristal violet), dibiarkan selama 60 detik
3. Cuci dengan air mengalir , kering anginkan
4. Ditetesi dengan gram B (lugol’s iodine), dibiarkan selama 60 detik
5. Dicuci dengan air mengalir, dikeringanginkan
6. Dicuci dengan gram C (etanol 96%) setetes demi setetes sampai etanol yang jatuh berwarna bening dan jangan sampai terlalu banyak
7. Ditetesi dengan gram D (safranin), dibiarkan selama 45 detik, dicuci dan dikering anginkan
8. Diamati di bawah mikroskop
Uji pewarnaan endospora
1. Dibuat ulasan bakteri pada objek glass lalu ditutup dengan kertas merang
2. Ditetesi dengan malachite green di atas kertas merang dan diletakan di atas air mendidih. Dibiarkan selama 5 menit, jika pinggir mulai mongering tambahkan lagi Malachite green.
3. Setelah dingin, object glass dibilas dengan akuades mengalir.
4. Tetesi dengan safranin sebagai counter stain.
5. Didiamkan selama 45 detik
6. Dicuci dan dikeringanginkan
7. Diamati di bawah mikroskop
Uji Motilitas
1. Isolat dari stok ditanam pada SIMA (Sulphide Indole Motility Agar)
2. Inkubasi pada suhu 300C selama 2×24 jam
3. Amati motilitas dari pertumbuhan bakteri yang terbentuk.
Uji hidrolisis starch
1. Diinokulasikan bakteri uji pada medium padat starch agar sebanyak 1 ose
2. Inkubasi pada suhu 300C selama 2×24 jam
3. Kemudian permukaan media digenangi dengan larutan lugol’s iodine
4. Diamati perubahan yang terjadi, jika terbentuk zona jernih di sekitar koloni menandakan hasil uji positif, dan jika tidak terbentuk zona jernih menandakan hasil uji negative
Uji hidrolisis kasein
1. Diinkubasi bakteri uji pada medium padat SMA sebanyak 1 ose
2. Dinkubasi pada suhu 300C selama 2×24 jam
3. Diamati perubahan yang terjadi , jika terbentuk zona jernih di sekitar koloni menandakan hasil uji positif, dan jika warna media tetap menandakan hasil uji negative
Uji VP (Voges Proskauer)
1. Bakteri uji ditumbuhkan pada medium cair MR-VP sebanyak 1 ose
2. Bakteri uji diinkubasi selama 2×24 jam pada temperatur 300C
3. Bakteri uji ditetesi KOH 40% 2 tetes-alfanaftol 3 tetes
4. Hasil positif jika terbentuk kompleks warna pink
Uji Katalase
1. Preparat ulas bakteri uji dibuat
2. Preparat ulas ditetesi dengan reagen H2O2
3. Perubahan diamati, hasil positif jika terbentuk gelembung gas dan hasil negatif jika tidak terbentuk gelembung gas.
Uji Oksidase
1. Dibuat preparat ulas bakteri pada objek glass, tutup dengan potongan tissue
2. Ditetesi dengan reagen oksidase
3. Diamati perubahan yang terjadi
4. Hasil positif jika berwarna biru marun, hasil negative tidak terbentuk warna biru marun
Uji Penggunaan Sitrat
1. Diinokulasikan bakteri uji pada medium agar miring simon citrate sebanyak 1 ose
2. Dinkubasi pada suhu 300C selama 2×24 jam
3. Diamati perubahan yang terjadi, jika hasil positif media berwarna biru sedangkan hasil negative tetap berwarna hijau
Uji Karbohidrat (Raffinosa/ laktosa)
1. Bakteri uji ditumbuhkan pada medium laktosa dan Raffinosa
2. Bakteri uji diinkubasi selama 2×24 jam pada temperatur 300C
3. Perubahan diamati, hasil positif jika media berubah warna dari ungu menjadi kuning dan hasil negatif jika media tetap berwarna ungu.
Uji Toleransi NaCl
1. Dibuat tiga buah tabung Nutrient broth yang mengandung NaCl 0%, 6,5 %, dan 10%
2. Diinokulasikan dengan streak kontinyu
3. Dinkubasi pada suhu 300C selama 2×24 jam
4. Amati hasilnya
Demikian artikel tentang Cara Isolasi dan Identifikasi Bacillus sp, semoga bermanfaat.